PCR-RFLP Based genetic diversity of Plasmodium vivax genotypes in district Mardan, Pakistan / Diversidade genética baseada em PCR RFLP de genótipos de Plasmodium vivax no distrito de Mardan, Paquistão

Plasmodium vivax is the most common human malaria parasite in Asian countries including Pakistan. Present study was designed to explore the genetic diversity of plasmodium vivax genotypes based on Pvmsp-3α and Pvmsp-3βgenes using allelic specific nested PCR and RFLP assays markers from field isolates in district Mardan, Pakistan. Blood samples of 200 P. vivax malarial patients were collected after taking their written informed consent. Genetic diversity in nested PCR products was determined by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizing Alu1 and PstI restriction enzymes for alpha and beta gene products digestion, respectively. For analysis the genetic diversity of the sub allelic variants of Pvmsp3α and Pvmsp3β genes, Chi-Square test was performed by utilizing Minitab programming software 18. The P value 0.05 was considered as statistically significant. For Pvmsp 3α genes after gel electrophoresis of digested products, four distinct genotypes were obtained from total of 50 samples; type A: 35 (70%) (1.5-2.0 kb), 12 of type B (24%) (1.5-1.7 kb), 2 of type C (4%) (0.5-1.5) and one for type D (2%) (0.5-0.65 kb) which could be characterized into 9 allelic pattern (A1-A4, B1-B3, C1, D), in which A3 remained the most predominant. For Pvmsp-3βgenes, three distinct genotypes were obtained from 50 samples; 40(80%) of type A (1.5-2.5 kb), 9 (18%) of type B (1.0-1.5kb) and 1(2%) of type C (0.65 kb) which could be characterized into 6 allelic patterns (A1-A3, B1-B2, and C1). Most dominant one in Type A was A1 alleles which were noted (46%), while in Type B, the most dominant were B1 (10%).This study is the first ever report of molecular epidemiology and genetic variation in Pvmsp-3α and Pvmsp-3β genes of P. vivax isolates by using PCR/RFLP from District Mardan and [...].

O Plasmodium vivax é o parasita da malária humana mais comum nos países asiáticos, incluindo o Paquistão. O presente estudo foi desenhado para explorar a diversidade genética de genótipos de Plasmodium vivax baseados nos genes Pvmsp-3α e Pvmsp-3β, usando marcadores de ensaios alélicos nested PCR e RFLP de isolados de campo no distrito de Mardan, Paquistão. Amostras de sangue de 200 pacientes com malária por P. vivax foram coletadas após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. A diversidade genética em produtos de PCR nested foi determinada por polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) utilizando as enzimas de restrição Alu1 e PstI para a digestão dos produtos dos genes alfa e beta, respectivamente. Para análise da diversidade genética das variantes subalélicas dos genes Pvmsp3α e Pvmsp3β, o teste Qui-quadrado foi realizado utilizando o software de programação Minitab 18. O valor P = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para os genes Pvmsp 3α, após eletroforese em gel de produtos digeridos, quatro genótipos distintos foram obtidos de um total de 50 amostras; tipo A: 35 (70%) (1,5-2,0 kb), 12 do tipo B (24%) (1,5-1,7 kb), 2 do tipo C (4%) (0,5-1,5) e um para o tipo D (2%) (0,5-0,65 kb), que podem ser caracterizados em nove padrões alélicos (A1-A4, B1-B3, C1, D), em que A3 permaneceu como o mais predominante. Para Pvmsp-3βgenes, três genótipos distintos foram obtidos a partir de 50 amostras; 40 (80%) do tipo A (1,5-2,5 kb), 9 (18%) do tipo B (1,0-1,5 kb) e 1 (2%) do tipo C (0,65 kb), que podem ser caracterizados em seis padrões alélicos (A1-A3, B1-B2 e C1). Os mais dominantes no tipo A foram o alelo A1, observados em 46%, enquanto, no tipo B, os mais dominantes foram B1 (10%). Este estudo é o primeiro relato de epidemiologia molecular e variação genética em Pvmsp-3α. Os genes Pvmsp-3β de isolados de P. vivax utilizando PCR/RFLP do Distrito Mardan mostraram um nível notável de diversidade genética nos genes estudados [...].

Tipificación del antígeno Duffy como método indirecto para identificar individuos asintomáticos de malaria / Duffy antigen typing as an indirect method to identify asymptomatic malaria individuals

En países considerados endémicos de malaria a pesar de las estrategias realizadas anualmente para el control y erradicación de esta enfermedad existen brotes aislados de malaria debido probablemente a portadores asintomáticos, presencia de individuos con fenotipo Duffy negativo o movimientos poblacionales. El sector "50 casas" de la provincia de Esmeraldas-Ecuador reúne todas estas características por lo que el objetivo de esta investigación fue determinar la presencia del fenotipo Fy(a-b-) y su relación con el Plasmodium vivax. Se realizó una encuesta a cada miembro de las familias participantes y luego de aceptado y firmado el consentimiento informado se tomaron muestras sanguíneas para la realización de pruebas serológicas en búsqueda de anticuerpos y antígenos de P. vivax, fenotipificación del sistema Duffy y pruebas de PCR en tiempo real para la determinación de ADN de Plasmodium vivax y P. falciparum. Los resultados demostraron que existe una asociación estadísticamente significativa entre el fenotipo Duffy y malaria por P. vivax (p<0,05). Ante esta situación los organismos de control deberán proponer nuevas estrategias para la detección de portadores asintomáticos y medidas preventivas para evitar nuevos brotes de malaria, así como determinar si P. vivax ha encontrado un nuevo mecanismo de invasión en individuos portadores del fenotipo Fy(a-b-).

Despite the strategies carried out annually for the control and eradication in countries considered endemic for malaria, there are isolated outbreaks probably due to asymptomatic carriers. These involve the presence of individuals with Duffy negative phenotype or population movements. The neighbourhood "50 casas" of the province of Esmeraldas-Ecuador has all these characteristics, so the purpose of this research was to determine the presence of the Fy(a-b-) phenotype and its relationship with the Plasmodium vivax. A survey was carried out into each member of the participating families and after accepting and signing the informed consent, blood samples were taken to perform serological tests in search of antibodies and antigens of P. vivax. The phenotyping of Duffy system and real-time PCR tests for DNA determination of Plasmodium vivax and falciparum was realized. The results showed that there is a statistically significant association between the Duffy phenotype and P. vivax malaria (p<0.05). In view of this situation, the control agencies should propose new strategies for the detection of asymptomatic carriers and preventive measures to hinder new outbreaks of malaria and determine if P. vivax has found a new invasion mechanism in individuals with the Fy(a-b-) phenotype.

Nos países considerados endêmicos para malária, apesar das estratégias realizadas anualmente para o controle e erradicação desta doença existem surtos isolados de malária, resultantes provavelmente de portadores assintomáticos, presença de indivíduos com fenótipo Duffy negativo ou movimentos populacionais. O setor "50 casas" na província de Esmeraldas-Equador reúne todas essas características. Portanto o objetivo desta pesquisa foi determinar a presença de fenótipo Fy(a-b-) e sua relação com Plasmodium vivax. Foi realizada uma enquete para cada membro das famílias participantes e após a aceitação e assinatura do Consentimento informado, foram coletadas amostras de sangue para a realização de testes sorológicos em busca de anticorpos e antígenos do P. vivax. Além de testes de fenotipagem do sistema Duffy e PCR em tempo real para determinação de DNA de Plasmodium vivax e P. falciparum. Os resultados mostraram que existe uma associação estatisticamente significante entre o fenótipo Duffy e a malária por P. vivax (p<0,05). Perante está situação os órgãos de fiscalização terão que propor novas estratégias para a detecção de portadores assintomáticos e medidas preventivas para evitar novos surtos de medidas de malária bem como determinar se P. vivax tem encontrado um novo mecanismo de invasão em indivíduos portadores do fenótipo Fy(a-b-).

Antígenos envolvidos na invasão dos reticulócitos pelo Plasmodium vivax: variabilidade genética do hospedeiro vertebrado e modulação da resposta imune humoral

O Plasmodium vivax infecta os reticulócitos por meio de uma via de invasão principal que envolve a interação entre a Duffy binding protein(região II, DBPII) e seu receptor nos reticulócitos, o antígeno de grupo sanguíneo Duffy receptor de quimiocinas (DARC). Contudo, uma via de invasão alternativa pode envolver uma proteína do parasito recém-descrita, denominada EBP2 (Erythrocyte Binding Protein 2). Apesar da exposição natural ao P. vivax induza uma resposta de anticorpos capaz de bloquear a interação DBPII-DARC, a maioria dos indivíduos expostos à malária não desenvolvem anticorpos inibitórios (binding inhibitory antibodies, BIAbs). Embora estudos prévios demonstraram que polimorfismos na DBPII contribuem para a baixa imunogenicidade da proteína, a influência da variabilidade genética do hospedeiro vertebrado nesta resposta tem sido pouco estudada. Neste contexto, o presente estudo investigou a contribuição dos polimorfismos genéticos do receptor DARC e do sistema HLA classe II na resposta deanticorpos contra a DBPII. Adicionalmente, caracterizamos a nova proteína EBP2 do P. vivax, incluindo avaliação das suas propriedades de ligação ao eritrócito/reticulócito e estudos de imunogenicidade. Para isso, um estudo prospectivo, do tipo coorte aberta, foi conduzido com 620 indivíduos naturalmente expostos ao P. vivax na região da Amazônia brasileira (comunidade de Rio Pardo/AM)

Este estudo incluiu cinco cortes transversais, sendo três conduzidas no primeiro ano de acompanhamento (linha-de-base, 6 e 12 meses) e dois cortes transversais, 6 e 7 anos depois. Nesta comunidade os alelos mais comuns do receptor DARC(FY*A, FY*B and FY*BES) foram genotipados por PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo-real, e as variantes do HLA II (loci DRB1, DQB1 and DQA1) genotipadas por PCR-SSO (PCR com oligonucleotídeos de sequência específica pela tecnologia Luminex). As respostas de anticorpos específicos foram avaliadas nos cortes tranversais por meio da sorologia convencional (anticorpos IgG detectados pelo ensaio de ELISA), bem como por ensaios funcionais de inibição (ensaios in vitro para detecção de BIAbs). Em conjunto, os resultados permitiram demonstrar que: (i) a variabilidade genética do receptor DARC influencia na resposta BIAbs anti-DBPII, sendo esses anticorpos inibitórios mais frequentes em indivíduos heterozigotos carreadores de um alelo chamado “não-funcional” ou silencioso de DARC (FY*BES); a habilidade dos polimorfismos de DARC em influenciar nas propriedades funcionais dos anticorpos pode ser detectada durante todo o período de acompanhamento (neste caso, 12-meses); (ii) a variabilidade genética do HLA II influenciou na aquisição e manutenção da resposta de anticorpos anti-DBPII, sendo que diferentes alelos e haplótipos influenciaram tanto na resposta detectada pela sorologia convencional (ELISA) quanto na de anticorpos funcionais (BIAbs)

Estudos de modelagem molecular das variantes HLA-DRB1 permitiram identificar diferenças estruturais, particularmente na fenda de ligação entre peptídeo-HLADRB1, que poderiam explicar os diferentes perfis de respondedores identificados. Com relação a EBP2, (iii) foi possível demonstrar que essa proteína se liga preferencialmente a reticulócitos imaturos (CD71 high) e DARC positivos; (iv) na população estudada, anticorpos anti-EBP2 foram mais frequentes que anticorpos anti-DBPII. De importância, 6 e 7 anos após o início do estudo, o perfil de resposta de anticorpos anti-EBP2 se manteve estável, mesmo com a redução dos níveis de transmissão de malária na região; no mesmo período, anticorpos anti-DBPII diminuíram significativamente. Em conclusão, os resultados aqui encontrados fornecem evidências de que a variabilidade genética do hospedeiro vertebrado deverá ser levada em consideração no desenvolvimento de vacinas baseadas na DBPII. Além disso, reforça os achados iniciais que sugerem que a EBP2 pode ser um candidato promissor para compor uma vacina contra as formas sanguíneas do P. vivax; além de ser altamente imunogênica na população estudada, a proteína apresenta características funcionais compatíveis com uma possível função na invasão de reticulócitos jovens (DARC positivos) pelo P. vivax

Antígenos candidatos à vacina contra as formas sanguíneas de Plasmodium vivax: avaliação da memória imunológica de longa duração

A invasão dos eritrócitos pelos parasitos da malária garante o sucesso da infecção humana e, consequentemente, o desenvolvimento da doença clínica. Desse modo, existe grande interesse no desenvolvimento de vacinas que possam induzir anticorpos que bloqueiem o ciclo sanguíneo do parasito. No caso de Plasmodium vivax, o principal antígeno candidato à vacina é a Duffy binding protein II (DBPII), único ligante conhecido para a invasão dos eritrócitos humanos. Embora anticorpos naturalmente adquiridos contra a DBPII induzam proteção, faz-se necessário avaliar se esta resposta gera memória imunológica de longa duração. O trabalho aqui desenvolvido teve como objetivo principal avaliar se a DBPII e outros antígenos candidatos à vacina contra P. vivax induzem resposta imune humoral (anticorpos e células B de memória, MBCs) de longa-duração.

A população de estudo foi constituída de indivíduos com história de exposição única a P. vivax, ocorrida em 2003, durante um surto de transmissão autóctone na região metropolitana de Belo Horizonte, Minas Gerais. Para tal, foram selecionados indivíduos que se infectaram (casos, n=13) ou não (não-casos, n=12) durante o período de transmissão. Como controle negativo, foram incluídos indivíduos nunca expostos à malária (BH, n=9). A resposta de anticorpos foi avaliada pela sorologia convencional (ELISA) utilizando como antígenos diferentes variantes da DBPII (Acre1 e Sal1) bem como outros antígenos candidatos à vacina (MSP119 e EBP2). A resposta de células B de memória para os mesmos antígenos foi avaliada pelo ensaio imunoenzimático que detecta MBCs diferenciadas em células secretoras de anticorpos IgG (ELISpot). Após padronizar o ensaio de ELISpot com sucesso, os nossos resultados demonstram que: (1) MBCs antígeno-específicas de vida-longa (12 anos após exposição) foram detectadas em todos os indivíduos do grupo caso e em parte dos indivíduos não-casos (58%), o que sugere que infecções assintomáticas podem ter ocorrido na época do surto; (2) a resposta celular de DBPII foi variante-específica, sendo a variante Acre1 (frequente na Amazônia brasileira) a mais imunogênica.

Neste contexto, a cepa de referência Sal1 ou um antígeno sintético desta cepa (DEKnull) apresentaram pouca ou nenhuma imunogenicidade; (3) a MSP119, presente na superfície do parasito, foi o antígeno mais imunogênico, seguido da EBP2, proteína recém-descrita em P. vivax; (4) em relação a sorologia convencional, anticorpos IgG para os diferente antígenos testados não perduraram após 12 anos de exposição única a P. vivax.Em conjunto, os resultados aqui apresentados permitiram concluir que uma única e breve exposição a P. vivax é capaz de induzir MBCs antígeno-específicas de vida longa, reforçando a importância de se estudar estas células na avaliação da memória imunológica da malária, particularmente, aquela induzida por antígenos candidatos à vacina.

Associação entre bimarcadores imunogenéticos e a gravidade ou resistência na malária por plasmodium vivax / Association between immunogenic markers and the severity and resistance in plasmodium vivax malaria

INTRODUÇÃO: A malária é uma das doenças infecto-parasitárias mais incidentes no mundo com grande morbimortalidade. Dentre as espécies infectivas ao ser humano, o Plasmodium vivax é a espécie predominante no Brasil, quase que exclusivamente na Região Amazônica. O espectro clínico da malária abrange desde uma infecção assintomática até casos moderados,com hiperbilirrubinemia isolada ou graves. A produção de mediadores inflamatórios pelo sistema imune, a via de metabolização do heme e os níveis sistêmicos de hepcidina são importantes mecanismos associados afisiopatologia dos diferentes desfechos clínicos da malária. Além disso, coinfecções podem modular ou intensificar a resposta imune de indivíduos infectados pelo plasmódio. OBJETIVO: Neste ínterim, a identificação de biomarcadores confiáveis tanto de gravidade ou resistência são indispensáveis para o auxílio no seguimento, diagnóstico e terapêutica da malária...

INTRODUCTION: Malaria is one of the most frequent infectious diseases inthe world with high morbidity and mortality. Among the infective species tohumans, Plasmodium vivax is the most predominant species in Brazil, withdisease incidence almost exclusively observed in the Amazon Region. Theclinical spectrum of malaria can range from asymptomatic infection to mildcases, malaria with isolated hyperbilirubinaemia or severe infection. Theimmune system production of inflammatory mediators, the heme metabolismpathway and systemic levels of hepcidin are important mechanismsassociated with pathophysiology of different malaria clinical outcomes. Inaddition, co-infections can modulate or enhance the immune response ofindividuals infected with P. vivax. OBJECTIVE: In this context, the identification of reliable biomarkers for disease severity and resistance are essential for the diagnosis, treatment and follow-up of malaria...

Influência de polimorfismos do receptor DARC (antígeno Duffy /receptor para quimiocinas) e do HLA (antígeno leucocitário humano) classe II na resposta imune humoral à Duffy binding protein do Plasmodium vivax

A Duffy binding protein do Plasmodium vivax (PvDBP) é uma proteína essencial para o processo de invasão do Plasmodium vivax em eritrócitos humanos Duffy/DARC positivos, sendo consequentemente uma forte candidata à vacina antimalárica. Apesar disso, estudos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa mostraram que a maioria dos indivíduos expostos à malária na Amazônia brasileira não desenvolvem anticorpos anti-PvDBP. Isto pode estar relacionado tanto a características do parasito quanto do hospedeiro vertebrado. Entre as características do parasito estão a baixa imunogenicidade da PvDBP ao sistema imune e o alto polimorfismo na região do ligante (região II). Entretanto, estas características do parasito não explicam o fato de que a maioria dos indivíduos expostos a diferentes variantes do parasito,por um longo período de tempo, não desenvolvem anticorpos bloqueadores da interação ligante-receptor.Diante disso, faz-se necessário avaliar características do hospedeiro vertebrado que poderiam influenciar nessa baixa resposta de anticorpos. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência de polimorfismos do receptor DARC e do HLA classe II (antígeno leucocitário humano) na resposta imune anti-PvDBP. O estudo foi do tipo coorte aberta de base populacional realizado em área de assentamento agrícola da Amazônia brasileira onde os indivíduos foram acompanhados por cerca de 12 meses. A abordagem metodológica envolveu: (i) genotipar o receptor Duffy/DARC (Real time PCR) e o HLA de classe II (locis HLA-DRB1, HLA-DQB1 e HLA-DQA1, por PCR-SSO) na população estudada (n=620); (ii)realizar ensaios sorológicos, convencionais (ELISA) e funcionais (bloqueio da interação DBPII-DARC) no plasma dos indivíduos estudados.

Os resultados mostram que, na área estudada, o genótipo de DARC mais frequente foi FY*A/FY*B, o que foi consistente com o que tem sido descrito para as populações residentes na Amazônia brasileira. Em relação à resposta de anticorpos, nenhuma associação significativa foi encontrada entre os genótipos de DARC e as respostas de anticorpos IgG no ELISA (região II ou regiões II-IV da PVDBP). Contudo, a resposta de anticorpos que inibem a interação ligante (DBPII) -receptor (DARC) foi significativamente mais frequente em indivíduos heterozigotos carreadores de um alelo DARC positivo (genótipos FY*A/FY*BES e FY*B/FY*BES). Em geral, a distribuição de frequência dosalelos de HLA classe II na população estudada corrobora com as frequências já descritas em estudos anteriores realizados no Brasil e na América Latina. De interesse, o estudo permitiu identificar 11 alelos de HLA classe II associados positivamente com a resposta de anticorpos anti-PvDBP detectados no ELISA,com destaque para os alelos DQA1*01:03 e HLA-DRB1*02:02. Por outro lado, o estudo permitiu identificar 4 alelos associados negativamente com a resposta de anticorpos. Além disso, quatro alelos - HLADQA1*02:01,HLA-DRB1*07:01, HLA-DQB1*02:02 e HLA-DQA1*02:01 - parecem influenciar positivamente na resposta de anticorpos inibitórios da interação DBPII-DARC, enquanto que o alelo HLA-DRB1*16:02 influenciou negativamente nesta resposta. Estes achados são de grande importância, pois, em áreas hiperendêmicas de malária, a resposta de anticorpos inibitórios tem sido associada com proteção clínica.Em conjunto, os resultados do presente estudo permitiram demonstrar, pela primeira vez, que polimorfismos do receptor DARC e do HLA classe II podem influenciar na resposta imune protetora contra a PvDBP.

A infecção malárica pelo Plasmodium simium/Plasmodium vivax em primatas não humanos de três regiões da Mata Atlântica brasileira

No Brasil, os casos de malária humana concentram-se na região amazônica.Entretanto, casos autóctones da doença têm sido relatados em diferentes regiões de Mata Atlântica. Sugere-se que a manutenção destes casos envolva a presença de macacos infectados. Nas regiões sul e sudeste do país circula o parasito de primatas Plasmodium simium, semelhante ao parasito de humanos P. vivax. No entanto, pouco se conhece sobre o parasito simiano e a sua proximidade morfológica, imunológica e genética com o P. vivax dificulta sua caracterização. Diante da necessidade de uma melhor compreensão da malária simiana, propôs-se neste trabalho realizar um levantamento da doença do ponto de vista clínico, molecular e imunológico em primatas de Mata Atlântica, dos estados Santa Catarina, Paraná e Mato Grosso do Sul. Em SC,foi observada uma taxa de infecção malárica pelo PCR de 35% em animais devida livre e 4% em animais de cativeiro.

Todos os animais do PR e MS foram negativos. Entretanto, em todos os estados foi identificado por meio do ELISA,uma reatividade de anticorpos contra as proteínas recombinantes PvDBPII,PvMSP-119 e PvAMA-1. Ainda, anticorpos presentes no soro de bugios foramcapazes de bloquear a interação PvDBP-DARC, com uma relação positiva entre a reatividade no ELISA e presença de anticorpos bloqueadores. Além disso, a interação específica PvDBP-DARC em amostras de bugios ruivos sugere que o parasito P. simium possui uma proteína ortóloga a PvDBP e dessa forma, compartilhe a mesma via de invasão que o P. vivax. A análise de microssatélites demonstrou alelos novos e exclusivos, trazendo perspectivas para a diferenciação das populações do parasito. Através da análise da diversidade genética das sequências obtidas de P. simium foi possível caracterizar polimorfismos conservados, sendo alguns deles nunca descritos em P. vivax. Contudo, apesar destes polimorfismos, a reconstrução da filogenia baseada nos genes DBP, MSP-1 e 18S não permitiu a separação das espécies, o que reforça a proximidade genética entre os parasitos e aponta para uma transferência de hospedeiros recente. Finalmente, a presença de símios infectados em áreas de Mata Atlântica sugere que os primatas possa matuar como reservatórios da doença, uma vez que casos humanos já foram descritos nas cidades estudadas.

Desenvolvimento de um protocolo de PCR em Tempo Real para diagnóstico de malária subpatente e infecções mistas por Plasmodium Vivax e Plasmodium falciparum

O diagnóstico adequado de malária permanece como um dos pilares dos programas de controle da doença no mundo, já que um diagnóstico eficiente permite a identificação precoce de casos e definição do esquema terapêutico, contribuindo para interrupção do ciclo biológico do parasito. A microscopia óptica (MO), atual diagnóstico de referência para malária, tem apresentado limitações, principalmente em casos de co-infecções e baixas parasitemias. Assim sendo, busca-se por técnicas mais sensíveis e específicas para auxiliar a MO, sendo os métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) considerados mais adequados para identificação de indivíduos com infecção submicroscópica. Entretanto, os vários protocolos de PCR apresentados até o momento tem se baseado no gene da subunidade menor do RNA ribossomal 18S dos plasmódios (18S rRNA), que se encontra em poucas cópias no genoma destes parasitos. Recentemente, foram descritas sequências não ribossomais para identificação de Plasmodium vivax(Pvr47) e Plasmodium falciparum (Pfr364), sendo estas sequências promissoras para o diagnóstico molecular de malária. Baseando-se nestes achados, este trabalho propôs o desenvolvimento de um protocolo de Real-Time PCR para validar os alvos Pvr47 e Pfr364 para o diagnóstico de malária vivax e falciparum,respectivamente, com ênfase em infecções mistas e baixas parasitemias. Após padronização com sucesso da técnica de Real-Time PCR (RT-LAMAL), a mesma foi comparada a três outros protocolos moleculares, sendo duas técnicas baseadas no gene 18S rRNA – Nested-PCR (Snounou et al., 1993) e Real-Time PCR (Mangold etal., 2005) – e uma PCR convencional baseada nos alvos Pvr47/Pfr364 (Demas etal., 2011).

Para avaliar os protocolos quanto aos seus limites de detecção de infecções únicas e mistas por P. vivax e P. falciparum, foram realizadas titulações de misturas artificiais com diferentes concentrações dos parasitos. Os resultados obtidos nesta etapa revelaram que a PCR-Demas e RT-LAMAL apresentaram os menores limites de detecção para P. vivax e P. falciparum, tanto em infecções únicas quanto mistas, e que o protocolo de RT-Mangold foi incapaz de detectar coinfecções.Posteriormente, os protocolos foram avaliados para o diagnóstico de malária em amostras de campo, incluindo área não endêmica (n=117) e área endêmica para malária (n=163). Os resultados revelaram que os protocolos de RT-Mangold,PCR-Demas e RT-LAMAL foram mais eficientes na detecção de parasitemias submicroscópicas, porém, o protocolo de RT-Mangold novamente mostrou ser incapaz de detectar infecções mistas. Em conjunto, os dados obtidos demonstraram que os alvos Pvr47/Pfr364 foram mais adequados para o diagnóstico molecular de malária vivax e falciparum do que o gene 18S rRNA. Contudo, o protocolo aqui desenvolvido (RT-LAMAL) se mostra em vantagem à PCR-Demas,com maior rapidez na obtenção de resultados, dispensando a revelação em gel deagarose e uso de brometo de etídeo, além de diminuir a possibilidade de contaminação de reagentes e amostras. Portanto, conclui-se que a RT-LAMAL possui grande potencial para o diagnóstico molecular de certeza de pacientes com infecções mistas e baixas parasitemias.

Influência de polimorfismos do receptor DARC (antígeno Duffy /receptor para quimiocinas) e do HLA (antígeno leucocitário humano) classe II na resposta imune humoral à Duffy binding protein do Plasmodium vivax / Influence of the DARC receptor polymorphisms (Duffy antigen / receptor for chemokines), and HLA (human leukocyte antigen) class II in the humoral immune response to the Duffy binding protein of Plasmodium vivax

A Duffy binding protein do Plasmodium vivax (PvDBP) é uma proteína essencial para o processo de invasão do Plasmodium vivax em eritrócitos humanos Duffy/DARC positivos, sendo consequentemente uma forte candidata à vacina antimalárica. Apesar disso, estudos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa mostraram que a maioria dos indivíduos expostos à malária na Amazônia brasileira não desenvolvem anticorpos anti-PvDBP. Isto pode estar relacionado tanto a características do parasito quanto do hospedeiro vertebrado. Entre as características do parasito estão a baixa imunogenicidade da PvDBP ao sistema imune e o alto polimorfismo na região do ligante (região II). Entretanto, estas características do parasito não explicam o fato de que a maioria dos indivíduos expostos a diferentes variantes do parasito,por um longo período de tempo, não desenvolvem anticorpos bloqueadores da interação ligante-receptor.Diante disso, faz-se necessário avaliar características do hospedeiro vertebrado que poderiam influenciar nessa baixa resposta de anticorpos. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência de polimorfismos do receptor DARC e do HLA classe II (antígeno leucocitário humano) na resposta imune anti-PvDBP. O estudo foi do tipo coorte aberta de base populacional realizado em área de assentamento agrícola da Amazônia brasileira onde os indivíduos foram acompanhados por cerca de 12 meses. A abordagem metodológica envolveu: (i) genotipar o receptor Duffy/DARC (Real time PCR) e o HLA de classe II (locis HLA-DRB1, HLA-DQB1 e HLA-DQA1, por PCR-SSO) na população estudada (n=620); (ii)realizar ensaios sorológicos, convencionais (ELISA) e funcionais (bloqueio da interação DBPII-DARC) no plasma dos indivíduos estudados...

Os resultados mostram que, na área estudada, o genótipo de DARC mais frequente foi FY*A/FY*B, o que foi consistente com o que tem sido descrito para as populações residentes na Amazônia brasileira. Em relação à resposta de anticorpos, nenhuma associação significativa foi encontrada entre os genótipos de DARC e as respostas de anticorpos IgG no ELISA (região II ou regiões II-IV da PVDBP). Contudo, a resposta de anticorpos que inibem a interação ligante (DBPII) -receptor (DARC) foi significativamente mais frequente em indivíduos heterozigotos carreadores de um alelo DARC positivo (genótipos FY*A/FY*BES e FY*B/FY*BES). Em geral, a distribuição de frequência dosalelos de HLA classe II na população estudada corrobora com as frequências já descritas em estudos anteriores realizados no Brasil e na América Latina. De interesse, o estudo permitiu identificar 11 alelos de HLA classe II associados positivamente com a resposta de anticorpos anti-PvDBP detectados no ELISA,com destaque para os alelos DQA1*01:03 e HLA-DRB1*02:02. Por outro lado, o estudo permitiu identificar 4 alelos associados negativamente com a resposta de anticorpos. Além disso, quatro alelos - HLADQA1*02:01,HLA-DRB1*07:01, HLA-DQB1*02:02 e HLA-DQA1*02:01 - parecem influenciar positivamente na resposta de anticorpos inibitórios da interação DBPII-DARC, enquanto que o alelo HLA-DRB1*16:02 influenciou negativamente nesta resposta. Estes achados são de grande importância, pois, em áreas hiperendêmicas de malária, a resposta de anticorpos inibitórios tem sido associada com proteção clínica.Em conjunto, os resultados do presente estudo permitiram demonstrar, pela primeira vez, que polimorfismos do receptor DARC e do HLA classe II podem influenciar na resposta imune protetora contra a PvDBP...

A infecção malárica pelo Plasmodium simium/Plasmodium vivax em primatas não humanos de três regiões da Mata Atlântica brasileira / Malaria infection caused by Plasmodium simium/Plasmodium vivax in non human primates from the brazilian Atlantic Forest

No Brasil, os casos de malária humana concentram-se na região amazônica.Entretanto, casos autóctones da doença têm sido relatados em diferentes regiões de Mata Atlântica. Sugere-se que a manutenção destes casos envolva a presença de macacos infectados. Nas regiões sul e sudeste do país circula o parasito de primatas Plasmodium simium, semelhante ao parasito de humanos P. vivax. No entanto, pouco se conhece sobre o parasito simiano e a sua proximidade morfológica, imunológica e genética com o P. vivax dificulta sua caracterização. Diante da necessidade de uma melhor compreensão da malária simiana, propôs-se neste trabalho realizar um levantamento da doença do ponto de vista clínico, molecular e imunológico em primatas de Mata Atlântica, dos estados Santa Catarina, Paraná e Mato Grosso do Sul. Em SC,foi observada uma taxa de infecção malárica pelo PCR de 35% em animais devida livre e 4% em animais de cativeiro...

Todos os animais do PR e MS foram negativos. Entretanto, em todos os estados foi identificado por meio do ELISA,uma reatividade de anticorpos contra as proteínas recombinantes PvDBPII,PvMSP-119 e PvAMA-1. Ainda, anticorpos presentes no soro de bugios foramcapazes de bloquear a interação PvDBP-DARC, com uma relação positiva entre a reatividade no ELISA e presença de anticorpos bloqueadores. Além disso, a interação específica PvDBP-DARC em amostras de bugios ruivos sugere que o parasito P. simium possui uma proteína ortóloga a PvDBP e dessa forma, compartilhe a mesma via de invasão que o P. vivax. A análise de microssatélites demonstrou alelos novos e exclusivos, trazendo perspectivas para a diferenciação das populações do parasito. Através da análise da diversidade genética das sequências obtidas de P. simium foi possível caracterizar polimorfismos conservados, sendo alguns deles nunca descritos em P. vivax. Contudo, apesar destes polimorfismos, a reconstrução da filogenia baseada nos genes DBP, MSP-1 e 18S não permitiu a separação das espécies, o que reforça a proximidade genética entre os parasitos e aponta para uma transferência de hospedeiros recente. Finalmente, a presença de símios infectados em áreas de Mata Atlântica sugere que os primatas possa matuar como reservatórios da doença, uma vez que casos humanos já foram descritos nas cidades estudadas...

Desenvolvimento de um protocolo de PCR em Tempo Real para diagnóstico de malária subpatente e infecções mistas por Plasmodium Vivax e Plasmodium falciparum / Development of a PCR protocol Real time to diagnosis of malaria and subpatent mixed infections with Plasmodium Vivax and Plasmodium falciparum

O diagnóstico adequado de malária permanece como um dos pilares dos programas de controle da doença no mundo, já que um diagnóstico eficiente permite a identificação precoce de casos e definição do esquema terapêutico, contribuindo para interrupção do ciclo biológico do parasito. A microscopia óptica (MO), atual diagnóstico de referência para malária, tem apresentado limitações, principalmente em casos de co-infecções e baixas parasitemias. Assim sendo, busca-se por técnicas mais sensíveis e específicas para auxiliar a MO, sendo os métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) considerados mais adequados para identificação de indivíduos com infecção submicroscópica. Entretanto, os vários protocolos de PCR apresentados até o momento tem se baseado no gene da subunidade menor do RNA ribossomal 18S dos plasmódios (18S rRNA), que se encontra em poucas cópias no genoma destes parasitos. Recentemente, foram descritas sequências não ribossomais para identificação de Plasmodium vivax(Pvr47) e Plasmodium falciparum (Pfr364), sendo estas sequências promissoras para o diagnóstico molecular de malária. Baseando-se nestes achados, este trabalho propôs o desenvolvimento de um protocolo de Real-Time PCR para validar os alvos Pvr47 e Pfr364 para o diagnóstico de malária vivax e falciparum,respectivamente, com ênfase em infecções mistas e baixas parasitemias. Após padronização com sucesso da técnica de Real-Time PCR (RT-LAMAL), a mesma foi comparada a três outros protocolos moleculares, sendo duas técnicas baseadas no gene 18S rRNA – Nested-PCR (Snounou et al., 1993) e Real-Time PCR (Mangold etal., 2005) – e uma PCR convencional baseada nos alvos Pvr47/Pfr364 (Demas etal., 2011)...

Para avaliar os protocolos quanto aos seus limites de detecção de infecções únicas e mistas por P. vivax e P. falciparum, foram realizadas titulações de misturas artificiais com diferentes concentrações dos parasitos. Os resultados obtidos nesta etapa revelaram que a PCR-Demas e RT-LAMAL apresentaram os menores limites de detecção para P. vivax e P. falciparum, tanto em infecções únicas quanto mistas, e que o protocolo de RT-Mangold foi incapaz de detectar coinfecções.Posteriormente, os protocolos foram avaliados para o diagnóstico de malária em amostras de campo, incluindo área não endêmica (n=117) e área endêmica para malária (n=163). Os resultados revelaram que os protocolos de RT-Mangold,PCR-Demas e RT-LAMAL foram mais eficientes na detecção de parasitemias submicroscópicas, porém, o protocolo de RT-Mangold novamente mostrou ser incapaz de detectar infecções mistas. Em conjunto, os dados obtidos demonstraram que os alvos Pvr47/Pfr364 foram mais adequados para o diagnóstico molecular de malária vivax e falciparum do que o gene 18S rRNA. Contudo, o protocolo aqui desenvolvido (RT-LAMAL) se mostra em vantagem à PCR-Demas,com maior rapidez na obtenção de resultados, dispensando a revelação em gel deagarose e uso de brometo de etídeo, além de diminuir a possibilidade de contaminação de reagentes e amostras. Portanto, conclui-se que a RT-LAMAL possui grande potencial para o diagnóstico molecular de certeza de pacientes com infecções mistas e baixas parasitemias...

Estudo de base populacional em um assentamento agrícola da Amazônia brasileira: Influência genética do antígeno Duffy/receptor de quimiocinas (DARC) na resposta imune específica contra o Plasmodium vivax / Population-based study in an agricultural settlement in the Brazilian Amazon: Genetic influence of the Duffy antigen / receptor for chemokines (DARC) in the specific immune response against Plasmodium vivax

A Duffy binding protein do Plasmodium vivax (PvDBP) e seu receptor na superfície dos eritrócitos, o antígeno Duffy/receptor para quimiocinas (DARC), estão envolvidos na principal via de invasão utilizada pelo P. vivax. No presente trabalho, realizou-se por um estudo do tipo coorte aberta, em área de assentamento agrícola da Amazônia brasileira, para avaliar a influência do receptor DARC na infecção e resposta imune ao P. vivax. Para isso, foi realizada a genotipagem do antígeno DARC através da técnica de PCR em tempo real. A pesquisa de anticorpos específicos foi realizada pela sorologia convencional (ELISA) e, por um ensaio funcional que avalia anticopos inibitórios da interação ligante-receptor. Entre os 690 indivíduos estudados, o genótipo FY*A/FY*B foi o mais frequente, consistente com a heterogeneidade étnica das populações que vivem na Amazônia brasileira. Na área estudada, não foi possível identificar associação entre a expressão DARC e a susceptibilidade a infecção pelo P. vivax. Em relação à resposta de anticorpos, nenhuma associação foi encontrada entre os genótipos de DARC e anticorpos IgG anti-PvDBP e anti-MSP119 (outra proteína do P. vivax), ambos detectados pela sorologia convencional (ELISA). Contudo, a resposta de anticorpos inibitórios foi significativamente mais frequente em indivíduos heterozigotos carreadores de um alelo DARC-negativo (genótipos FY*A/FY*BES eFY*B/FY*BES). Por último, a resposta de anticorpos inibitórios se manteve estável durante todo o período estudado (12 meses). Em conjunto, estes resultados demonstraram, pela primeira vez, que a expressão do receptor DARC pode influenciar na resposta imune inibitória contra a PvDBP.

Estudo de base populacional em um assentamento agrícola da Amazônia brasileira: Influência genética do antígeno Duffy/receptor de quimiocinas (DARC) na resposta imune específica contra o Plasmodium vivax

A Duffy binding protein do Plasmodium vivax (PvDBP) e seu receptor na superfície dos eritrócitos, o antígeno Duffy/receptor para quimiocinas (DARC), estão envolvidos na principal via de invasão utilizada pelo P. vivax. No presente trabalho, realizou-se por um estudo do tipo coorte aberta, em área de assentamento agrícola da Amazônia brasileira, para avaliar a influência do receptor DARC na infecção e resposta imune ao P. vivax. Para isso, foi realizada a genotipagem do antígeno DARC através da técnica de PCR em tempo real. A pesquisa de anticorpos específicos foi realizada pela sorologia convencional (ELISA) e, por um ensaio funcional que avalia anticopos inibitórios da interação ligante-receptor. Entre os 690 indivíduos estudados, o genótipo FY*A/FY*B foi o mais frequente, consistente com a heterogeneidade étnica das populações que vivem na Amazônia brasileira. Na área estudada, não foi possível identificar associação entre a expressão DARC e a susceptibilidade a infecção pelo P. vivax. Em relação à resposta de anticorpos, nenhuma associação foi encontrada entre os genótipos de DARC e anticorpos IgG anti-PvDBP e anti-MSP119 (outra proteína do P. vivax), ambos detectados pela sorologia convencional (ELISA). Contudo, a resposta de anticorpos inibitórios foi significativamente mais frequente em indivíduos heterozigotos carreadores de um alelo DARC-negativo (genótipos FY*A/FY*BES eFY*B/FY*BES). Por último, a resposta de anticorpos inibitórios se manteve estável durante todo o período estudado (12 meses). Em conjunto, estes resultados demonstraram, pela primeira vez, que a expressão do receptor DARC pode influenciar na resposta imune inibitória contra a PvDBP

Estudo comparativo da variabilidade genética de plasmodium vivax provenientes de infecções primáriae episódios de recaída após tratamento com primaquina e cloroquina / Comparative study of genetic variability of plasmodium vivax from primary infection and episodes of relapse after treatment chloroquine and primaquine

A malária humana é causada por protozoários do gênero Plasmodium.Aproximadamente 40% da população mundial encontra-se em risco de infecção. NoBrasil foram registrados 333.339 casos da doença em 2010, sendo 85% delescausados pelo Plasmodium vivax. O P. vivax apresenta uma característicaimportante em seu ciclo de vida, a possibilidade de desenvolver formas latentes nofígado, os hipnozoítos, que podem causar episódios de recaída. Pouco se sabe arespeito dos mecanismos de latência e ativação dos hipnozoítos. Porém dados daliteratura relatam uma correlação entre cepa do parasito e padrão de recaída,sugerindo uma programação genética dos parasitos. A escassez de marcadoresgenéticos para P. vivax tem dificultado as análises de importantes fenótipos doparasito, tais como os padrões de recaídas. Nesse contexto, o objetivo do presentetrabalho foi estudar a variabilidade dos parasitos presentes nas infecções primáriase nos episódios de recaída. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientesforam genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares (08 microssatélites e osblocos 2 e 10 da MSP-1) através de eletroforese capilar em sequenciadorautomático de DNA. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foiconfirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados e genotipagem apartir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foidemonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos emrelação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelospredominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelospor marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentesepisódios da doença num mesmo paciente. A principal contribuição deste trabalhofoi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primáriascomo nas recaídas, pela primeira vez demonstrada, sendo que infecções múltiplaspuderam ser identificadas com apenas 5 marcadores. A presença de repetidasrecaídas após o tratamento cloroquina/primaquina pode sugerir presença deparasitos resistentes ao tratamento. Com estes resultados espera-se contribuir parao esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitosdas recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento otratamento e auxiliando no controle da doença.

Estudo comparativo da variabilidade genética de Plasmodium vivax provenientes de infecções primáriae episódios de recaída após tratamento comPrimaquina e Cloroquina / Comparative study of genetic variability of Plasmodium vivax from primary infection and episodes of relapse after treatment Chloroquine and Primaquine

A malária humana é causada por protozoários do gênero Plasmodium.Aproximadamente 40% da população mundial encontra-se em risco de infecção. NoBrasil foram registrados 333.339 casos da doença em 2010, sendo 85% delescausados pelo Plasmodium vivax. O P. vivax apresenta uma característicaimportante em seu ciclo de vida, a possibilidade de desenvolver formas latentes nofígado, os hipnozoítos, que podem causar episódios de recaída. Pouco se sabe arespeito dos mecanismos de latência e ativação dos hipnozoítos. Porém dados daliteratura relatam uma correlação entre cepa do parasito e padrão de recaída,sugerindo uma programação genética dos parasitos. A escassez de marcadoresgenéticos para P. vivax tem dificultado as análises de importantes fenótipos doparasito, tais como os padrões de recaídas. Nesse contexto, o objetivo do presentetrabalho foi estudar a variabilidade dos parasitos presentes nas infecções primáriase nos episódios de recaída. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientesforam genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares (08 microssatélites e osblocos 2 e 10 da MSP-1) através de eletroforese capilar em sequenciadorautomático de DNA. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foiconfirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados e genotipagem apartir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foidemonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos emrelação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelospredominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelospor marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentesepisódios da doença num mesmo paciente. A principal contribuição deste trabalhofoi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primáriascomo nas recaídas, pela primeira vez demonstrada, sendo que infecções múltiplaspuderam ser identificadas com apenas 5 marcadores. A presença de repetidasrecaídas após o tratamento cloroquina/primaquina pode sugerir presença deparasitos resistentes ao tratamento. Com estes resultados espera-se contribuir parao esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitosdas recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento otratamento e auxiliando no controle da doença.

Estudo comparativo da variabilidade genética de Plasmodium vivax provenientes de infecções primáriae episódios de recaída após tratamento comPrimaquina e Cloroquina

A malária humana é causada por protozoários do gênero Plasmodium.Aproximadamente 40% da população mundial encontra-se em risco de infecção. NoBrasil foram registrados 333.339 casos da doença em 2010, sendo 85% delescausados pelo Plasmodium vivax. O P. vivax apresenta uma característicaimportante em seu ciclo de vida, a possibilidade de desenvolver formas latentes nofígado, os hipnozoítos, que podem causar episódios de recaída. Pouco se sabe arespeito dos mecanismos de latência e ativação dos hipnozoítos. Porém dados daliteratura relatam uma correlação entre cepa do parasito e padrão de recaída,sugerindo uma programação genética dos parasitos. A escassez de marcadoresgenéticos para P. vivax tem dificultado as análises de importantes fenótipos doparasito, tais como os padrões de recaídas

Nesse contexto, o objetivo do presentetrabalho foi estudar a variabilidade dos parasitos presentes nas infecções primáriase nos episódios de recaída. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientesforam genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares (08 microssatélites e osblocos 2 e 10 da MSP-1) através de eletroforese capilar em sequenciadorautomático de DNA. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foiconfirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados e genotipagem apartir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foidemonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos emrelação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelospredominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelospor marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentesepisódios da doença num mesmo paciente. A principal contribuição deste trabalhofoi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primáriascomo nas recaídas, pela primeira vez demonstrada, sendo que infecções múltiplaspuderam ser identificadas com apenas 5 marcadores. A presença de repetidasrecaídas após o tratamento cloroquina/primaquina pode sugerir presença deparasitos resistentes ao tratamento. Com estes resultados espera-se contribuir parao esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitosdas recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento otratamento e auxiliando no controle da doença

Caracterização do receptor DARC (Duffy Antigen/Receptor for Chemokines) e da resposta imune anti Duffy Binding Protein em indivíduos expostos ao Plasmodium vivax / Characterization of the receptor DARC (Duffy Antigen / Receptor for Chemokines) and the immune response anti Duffy Binding Protein in individuals exposed to Plasmodium vivax

O processo de invasão dos eritrócitos pelos plasmódios é complexo, sendo mediado por interações moleculares específicas do tipo ligante receptor. No caso do Plasmodium vivax, a invasão é altamente dependente do antígeno de grupo sanguíneo Duffy (DARC), presente na superfície dos eritrócitos, que interage com uma proteína do parasito, a Duffy binding protein (PvDBP). Considerando a importância do. receptor DARC como principal via de invasão do P. vivax, no presente estudo desenvolveu-se uma metodologia para genotipagem do receptor DARC. A técnica foi realizada através da PCR em tempo real, em sistema multiplex, o que otimizou o método de genotipagem em larga escala e reduziu o custo. Esta nova metodologia permitiu genotipar o receptor DARC dos indivíduos que participaram de um estudo. epidêmico de malária e de outros estudos com indivíduos de diferentes áreas endêmicas da região Amazônica brasileira. No presente trabalho, para avaliar a influência de DARC na infecção pelo P. vivax, duas abordagens metodológicas foram utilizadas: um estudo de prevalência e um de incidência do tipo prospectivo. Para o estudo que buscou associação de DARC com a prevalência de malária por P. vivax, foram estudados indivíduos, proveniente de outros estados brasileiros, que migraram para a Amazônia.

Nesta população foi observado que os indivíduos que possuíam dois alelos DARC funcionais apresentavam um maior risco de infecção ao P. vivax. Já no estudo prospectivo de base populacional, o receptor DARC foi genotipado em cerca de 800 indivíduos nativos da Amazônia, residentes em um assentamento agrícola na Amazônia. Embora nenhuma associação tenha sido encontrada entre o genótipo. DARC e infecção pelo P. vivax, os resultados sugeriram que o receptor DARC influenciou na resposta de anticorpos. Nesta área, indivíduos com apenas um alelo funcional (FY*B/FY*BES) apresentaram uma resposta maior de anticorpos anti-PvDBP. Estes achados são importantes, já que a relação entre DARC e a resposta de anticorpos anti-PvDBP tem sido pouco estudada. Além disso, foram determinados os. genótipos de DARC em indivíduos residentes em uma área de transmissão epidêmica de malária por P. vivax (surto ocorrido na região metropolitana de Belo Horizonte, MG), onde se avaliou também a resposta de anticorpos anti-PvDBP. Na área do surto, a caracterização dos genótipos de DARC dos indivíduos expostos à transmissão demonstrou que os diferentes genótipos estavam igualmente distribuídos entre aqueles que se infectaram e os não infectados. Por último, nesta área do surto epidêmico, estudou-se a cinética da resposta dos anticorpos anti-PvDBP. O resultados mostraram que anticorpos anti-PvDBP são de curta duração e específicos para a variante do parasito que causou o surto. Em conjunto, acredita-se que os resultados apresentados aqui possam contribuir para os estudos que visem o melhor entendimento da relação entre DARC, resposta imune e susceptibilidade a infecção pelo P. vivax.

Caracterização do receptor DARC (Duffy Antigen/Receptor for Chemokines) e da resposta imune anti Duffy Binding Protein em indivíduos expostos ao Plasmodium vivax

O processo de invasão dos eritrócitos pelos plasmódios é complexo, sendo mediado por interações moleculares específicas do tipo ligante receptor. No caso do Plasmodium vivax, a invasão é altamente dependente do antígeno de grupo sanguíneo Duffy (DARC), presente na superfície dos eritrócitos, que interage com uma proteína do parasito, a Duffy binding protein (PvDBP). Considerando a importância do. receptor DARC como principal via de invasão do P. vivax, no presente estudo desenvolveu-se uma metodologia para genotipagem do receptor DARC. A técnica foi realizada através da PCR em tempo real, em sistema multiplex, o que otimizou o método de genotipagem em larga escala e reduziu o custo. Esta nova metodologia permitiu genotipar o receptor DARC dos indivíduos que participaram de um estudo. epidêmico de malária e de outros estudos com indivíduos de diferentes áreas endêmicas da região Amazônica brasileira. No presente trabalho, para avaliar a influência de DARC na infecção pelo P. vivax, duas abordagens metodológicas foram utilizadas: um estudo de prevalência e um de incidência do tipo prospectivo. Para o estudo que buscou associação de DARC com a prevalência de malária por P. vivax, foram estudados indivíduos, proveniente de outros estados brasileiros, que migraram para a Amazônia.

Nesta população foi observado que os indivíduos que possuíam dois alelos DARC funcionais apresentavam um maior risco de infecção ao P. vivax. Já no estudo prospectivo de base populacional, o receptor DARC foi genotipado em cerca de 800 indivíduos nativos da Amazônia, residentes em um assentamento agrícola na Amazônia. Embora nenhuma associação tenha sido encontrada entre o genótipo. DARC e infecção pelo P. vivax, os resultados sugeriram que o receptor DARC influenciou na resposta de anticorpos. Nesta área, indivíduos com apenas um alelo funcional (FY*B/FY*BES) apresentaram uma resposta maior de anticorpos anti-PvDBP. Estes achados são importantes, já que a relação entre DARC e a resposta de anticorpos anti-PvDBP tem sido pouco estudada. Além disso, foram determinados os. genótipos de DARC em indivíduos residentes em uma área de transmissão epidêmica de malária por P. vivax (surto ocorrido na região metropolitana de Belo Horizonte, MG), onde se avaliou também a resposta de anticorpos anti-PvDBP. Na área do surto, a caracterização dos genótipos de DARC dos indivíduos expostos à transmissão demonstrou que os diferentes genótipos estavam igualmente distribuídos entre aqueles que se infectaram e os não infectados. Por último, nesta área do surto epidêmico, estudou-se a cinética da resposta dos anticorpos anti-PvDBP. O resultados mostraram que anticorpos anti-PvDBP são de curta duração e específicos para a variante do parasito que causou o surto. Em conjunto, acredita-se que os resultados apresentados aqui possam contribuir para os estudos que visem o melhor entendimento da relação entre DARC, resposta imune e susceptibilidade a infecção pelo P. vivax.

Comparison of the clinical profile and complications of mixed malarial infections of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax versus Plasmodium falciparum mono-infection

This study aimed to compare the clinical presentations and complications in patients having mixed malaria infection of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax with those of patients with malaria due to a P. falciparum mono-infection. The medical records of malaria patients admitted to Kasturba Medical College, Manipal, India, during the years 2008-10 were analysed. Inclusion criteria were patients in whom P. falciparum and P vivax coinfection or P. falciparum mono-infection alone was confirmed on peripheral smear examination. Exclusion criteria were patients in whom P vivax infection alone was diagnosed on peripheral smear examination. The sample size was twenty patients diagnosed with mixed infection of P. falciparum and P vivax and 60 patients diagnosed with P falciparum mono-infection. 35% of mixed infections had thrombocytopenia as compared to 51.7% of P falciparum mono-infections. A total of 5% of the mixed infections had renal failure as compared to 16.7% of the falciparum mono-infections. Total bilirubin was raised in 15.8% of mixed infections and in 46.6% of falciparum mono-infections. Abnormal liver enzymes were seen in 36.8% of mixed infections and in 66.6% of falciparum mono-infections. None of the mixed infections had a parasite index over 2% while it was present in 28% of the falciparum mono-infections. Patients with mixed infections were found to have a lower incidence of severe complications such as anaemia, thrombocytopenia, liver and renal dysfunction and a lower parasite index. Thus mixed malaria tends to have a more benign course as compared to malaria due to P. falciparum mono-infection